У 1586 р. Львівське братство прийняло новий статут, який був затверджений антіохійським патріархом Йоакимом. Воно підпорядковувалось безпосередньо вселенським патріархам й дістало право контролювати єпископа. У 1593 р. константинопольський патріарх Ієремія надав Успенській братській церкві права патріаршої ставропігії, тобто звільнив її від підпорядкування єпископу й митрополиту. Відтоді братство стало називати себе Ставропігійським братством, підкреслюючи цим свою незалежність від місцевої церковної влади і своє право контролювати церковне життя, духовенство та єпископат. Згідно зі статутом Львівська ставропігія була всестановою інституцією, до якої міг вступити «всякий, хто б він не був: міщанин, або шляхтич, передміщанин або будь-хто з посполитих людей».
На таких самих організаційних засадах наприкінці XVI ст. виникають братства у Рогатині, Красноставі, Бересті, Городку, Комарні, Любліні, згодом – на Волині, Поділлі, Наддніпрянщині. Пізніше утворилися братства у Києві (1615) і Луцьку (1617).
Провідну роль у діяльності братств відігравало міщанство. Серед перших активних львівських братчиків бачимо здебільшого представників середніх верств – братів Рогатинців, Красовських, Хому Бабича, Івана Богатирця та інших. Разом з тим були й репрезентанти впливового і заможного патриціату (наприклад, згадуваний уже купець Костянтин Корнякт). Лист львівських братчиків до патріарха Ієремії (6 лютого 1592 р.) засвідчує між членами братства українських і білоруських православних магнатів – новогрудського воєводу Федора СкуминаТишкевича, берестейського каштеляна Іпатія Потія (майбутнього ініціатора Берестейської унії); до «Альбому» братства (своєрідної членської книги) були вписані князі Адам Вишневецький, Кирик та Роман Ружинські, сенатор Адам Кисіль, деякі молдавські господарі, їхні бояри та інші. Якщо зважити, що з усіх станів Речі Посполитої лише шляхта (незалежно від віросповідання) мала голос на сеймах та сеймиках і була єдиною повноправною верствою, то її підтримка вимог братств надавала цим вимогам потужного суспільного звучання. Серед братчиків бачимо і представників духовенства, зокрема найвищої його ієрархії: київського митрополита Михайла Рогозу, дерманського архімандрита Генадія, пресвітера Софійського собору Филипа Атанасевича, київського архідиякона Гаковича.
Залучення до діяльності братств широких верств українського суспільства перетворює їх на загальнонаціональну інституцію, що бере активну участь у суспільно-політичному і культурно-національному житті України наприкінці XVI – на початку XVII ст. Одним з найважливіших завдань, які вирішували братства, була боротьба за оновлення церковно-релігійного життя на Україні, піднесення культурно-освітнього рівня православного духовенства, відродження його суспіль-ного призначення. Українська церква після втрати Україною решток державності наприкінці XV ст. переживала тяжку кризу. Вона опинилася без могутньої підтримки держави, якою користувалася від початків свого становлення, і була вже не в силі відігравати суспільно-культурну роль, властиву їй у староруський період.
Мірою поширення польських впливів і переходу шляхетсько-магнатської верхівки до католицтва православна церква в Україні також зазнавала дедалі відчутніших втрат, позбавлялася значної матеріальної і моральної підтримки найбільш впливової і заможної верстви. Великої шкоди українській церкві завдавало право патронату короля, яке давало йому змогу впливати на призначення найвищих церковних ієрархів. На ці посади часто призначалися особи, пройняті мирськими інтересами, далекими від високого призначення духовного пастиря. В результаті православні церковні ієрархи мало чим відрізнялися від світських феодалів, не приділяли належної уваги піднесенню духовного, культурного і організаційного рівня церковного життя. Вище духовенство та єпископат виявилися нездатними боронити інтереси православних віруючих перед наступом католицизму з огляду на свій невисокий загальний культурний рівень і невміння створити відповідну часові систему освіти. Нижчі духовні чини також дуже часто були малоосвіченими, вели невідповідний санові спосіб життя і, отже, не могли здійснювати належний вплив на свою паству. Українська православна церква, таким чином, опинилась у такому самому стані, як і католицька церква західноєвропейських країн напередодні Реформації (переживала так звану «порчу»).
В цих умовах братства стали своєрідною формою реформаційного руху, одним з напрямків діяльності якого було оновлення православної церкви. Братства надали Реформації в Україні демократичного характеру, поставивши в центр уваги низку соціальних аспектів. Уся їхня освітньо-культурна діяльність була спрямована на ліквідацію монополії привілейованих верств на освіту, коментування богословських творів, на загальне піднесення духовного життя суспільства.
У статуті Львівської братської школи було записано, що «богатые над убогими в школе нечим вышшим не мают быти, только самою наукою, плотию же равно вси…», «учити дидаскал и любити мает дети все заровно, як сынов богатых, так и сирот убогих, й которые ходят по улицам живности просячи…»
Львівській та іншим братським школам було властиве прагнення втілити в життя гуманістичну ідею світської освіти. Королівська грамота 1592 р., виклопотана лідерами українських і білоруських магнатів К. Острозьким та Ф. СкуминоюТишкевичем, дала змогу розширити програму навчання у братських школах відповідно до вимог часу, зокрема запровадити у шкільному навчанні латинську мову.
Саме братства активно виступали за переклад і видання Біблії рідною мовою, що було важливим аспектом реформаційного руху в країнах Європи. Піднесення престижу і гідності рідної мови, боротьба за її належне місце в суспільному житті сприяли національному самоутвердженню і стали визначальними рисами національно-визвольної боротьби українського народу.
Вплив Реформації на братський рух виявився у намаганнях братчиків подолати зловживання ієрархії, а також у вимогах самостійного вирішення мирянами справ церковних громад. Ідея соборного правління здобула собі прибічників у широких верствах міщан, козаків, нижчого духовенства і стала, таким чином, виявом реформаторських тенденцій до більш широкого залучення світських осіб до вирішення церковних питань. Братства прагнули зберегти чистоту християнської віри й моралі між усіма віруючими, незалежно від становища у церковній ієрархії. «Коли й єпископ пішов би проти закона та почав би правити церквою не по правилах святих апостолів та святих отців, навертаючи праведних до неправди і підтримуючи беззаконників, то нехай всі противляться такому єпископові, як ворогові правди», – зазначалось в статуті львівського Успенського братства. Подібні вимоги стояли в одному ряду зі спільними і для протестантів, і католиків принципами, що виправдовували виступи проти «нечестивих» церковних ієрархів і «єретичних» монархів.
Наприкінці XVI – на початку XVII ст. братства Галичини виступили проти львівського православного єпископа Гедеона Балабана. Українська православна ієрархія, яка досі знаходила спільну мову з братствами, була явно незадоволена правами, наданими ним патріархам. Львівський першоієрарх – родовитий шляхтич, що дістав владицтво у спадок від батька і мав намір передати його своєму племінникові – не хотів підпорядковуватись гурту «хлопів простих – кушнірів, кожум’яків, сідельників». Позитивним моментом такого підпорядкування було деяке оздоровлення церковного життя. Разом з тим, контроль братств над єпископами у своїй основі був неканонічним, а отже викликав кризу серед вищої православної ієрархії і прискорював перехід більшої її частини до унії.
Боротьба за оновлення православної церкви часом переростала – як і в деяких західноєвропейських реформаційних течіях – у заперечення церкви взагалі. Прикладом цьому є діяльність викладача Львівської братської школи Стефана Зизанія. Він доводив, що церква непотрібна для спілкування з Богом, виступав за її перетворення на безпастирську громаду. У боротьбі проти католицизму він застосовував чимало західноєвропейських реформаційних ідей і водночас вживав їх для критики православної церковної верхівки. Використовуючи популярний серед реформаторів закид папі – зображуючи його антихристом, Зизаній ставить поряд з ним православного митрополита Михайла Рогозу. Соціальний і релігійний радикалізм Стефана Зизанія робив його небезпечним для верхів як католицького, так і православного духовенства, викликав переслідування з боку королівської влади.
Братства відіграли важливу роль у боротьбі з католицькою експансією. Вони зміцнили українські громади у містах, які тепер могли спертися на мережу шкіл, друкарень, кадри освічених людей, вихованих як за кордоном, так і у власній школі. Ціла низка видатних церковних і світських діячів вийшла з братських шкіл і принесла своїй батьківщині величезну користь. Особливу увагу братства приділяли вдосконаленню проповіді, домагаючись від українських пастирів високого фахового рівня і здатності полемізувати з висококваліфікованими єзуїтськими «казнодзеями». Братства використовували всі доступні їм заходи в обороні православної віри, протистояли національній дискримінації. Вони постійно направляють депутації до короля, ведуть судові процеси, здійснюють тиск на судові трибунали. Прикметно, що з 1616 р. у Варшаві постійно перебувають братські представники, які виступають захисниками у церковних справах. Особливо зросла роль братств у боротьбі з католицизмом після Берестейської унії, коли було ліквідовано православну ієрархію. Братства здобувають дедалі могутнішу підтримку всіх верств населення, зокрема козацтва, і стають надзвичайно важливим засобом захисту українського народу від денаціоналізації і соціально-політичної деградації.