Один із небагатьох храмів, зведених на Лівобережжі в період Руїни, глухівська Миколаївська церква поєднує в собі затишність традиційного українського храму з монументальністю державного стилю, що зароджувався. Як і більшість споруд домазепинського періоду, Миколаївська церква двоярусна (перший ярус утворюють стіни, другий – барабани куполів), однак зодчі надали своїй будівлі стрункості, підкресленої контурами пілястр і лініями лиштв. Фасади храму прикрашені строгим антаблементом і фігурними фронтончиками.
Спочатку храм був тридільним і симетричним: навколо центрального купола розташовувалися два бічні, однакові за висотою. В 1871 р. для того щоб наблизити храм до російського «корабельного» планування, замість східного купола звели триярусну дзвіницю, яка, врешті, непогано вписалася в силует храму.
Миколаївська церква в Глухові набула сумної слави через те, що саме в її стінах у 1709 р. було проголошено анафему гетьману Мазепі. Намісник патріаршого престолу Москви Стефан Яворський (1658-1722 рр.), який склав текст анафеми, наступного дня написав гнівну проповідь, у якій різко засуджував Петра І. Зрозуміло, свою проповідь Яворський запобіжливо зберігав «у столі», але втриматися від протесту, хоча б таємного, не зміг. Іван Скоропадський(прав. 1709-1722 рр.), котрий у тому ж глухівському храмі прийняв гетьманську булаву, так само мимоволі виказав своє ставлення до подій: у документах гетьманської канцелярії він називає Мазепу «мій антицесор» або «колишній гетьман», жодного разу не назвавши його зрадником, як того вимагав Петро І